Alkuperäis­tutkimus 11/1994 vsk 49 s. 1139

Apolipoproteiini B:n ja E:n perinnöllinen vaihtelu ja seerumin kolesteroli

Apolipoproteiinien E ja B peritty rakenne säätelee suomalaisilla lapsilla ja nuorilla keskeisenä tekijänä seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolipitoisuutta. Suomalaisessa 9-24-vuotiaiden aineistossa nämä pitoisuudet lisääntyivät asteittain sekä apoB:n genotyyppien X1X1, X1X2 ja X2X2 että apoE:n fenotyyppien E3/2, E3/3 ja E4/3 mukaan. Seerumin LDL-kolesterolipitoisuus oli 24 % pienempi niillä tutkituilla, joilla oli perimäyhdistelmä E3/2+X1X1 kuin niillä, joilla oli E4/3+X2X2 yhdistelmä. Seerumin HDL-kolesteroli- ja triglyseridipitoisuuksissa ei ollut vastaavanlaisia eroja.

Terho LehtimäkiKimmo KontulaKatriina Aalto-SetäläKimmo Porkka Christian EhnholmJorma ViikariTapio Nikkari

Suurentuneeseen seerumin LDL-kolesterolipitoisuuteen liittyy lisääntynyt ateroskleroosin riski, kun taas HDL-kolesterolilla on päinvastainen, suojaava vaikutus (1). Apolipoproteiini E:n (apoE) ja B:n (apoB) perinnölliset vaihtelut säätelevät seerumin LDL-kolesterolipitoisuutta (2-4). ApoE:tä on runsaasti kylomikroneissa, kylomikronijäänteissä, VLDL:ssä (very-low density lipoprotein), IDL:ssä (intermediate-density lipoprotein) ja hieman HDL:ssä (high-density lipoprotein) (5). ApoB on LDL:n tärkein rakenneproteiini (6,7), ja se on välttämätön VLDL:n synteesissä ja metaboliassa. ApoB:n aminoterminaalista osaa (apoB48) tarvitaan kylomikronien synteesiin ja eritykseen (8). ApoB:n ja apoE:n ehkä tärkein fysiologinen tehtävä onkin toimia ligandeina maksan reseptoreille ja välittää lipoproteiinien poistumista verenkierrosta maksaan apoE- ja apoB, E-reseptorien kautta (9).

ApoE:n geenillä on kolme alleelia e2, e3, ja e4, jotka koodaavat proteiinisynteesissä vastaavia apoE:n alatyyppejä E2, E3 ja E4 (10,11). Perimme vanhemmiltamme kummaltakin yhden apoE:n alleelin eli jonkin fenotyypeistä E2/2, E3/2, E4/2, E3/3, E4/3 ja E4/4 (10). Pääosa viime vuosien tutkimustuloksista tukee ajatusta, että e2 on sepelvaltimotaudin suojatekijä ja että e4 lisää tämän taudin vaaraa (3).

ApoB:n XbaI-polymorfismi on seurausta yhden emäksen vaihtelusta siinä apoB:n geenin kohdassa, joka koodittaa apoB-ketjun paikalla 2488 sijaitsevaa aminohappoa (12). Tämä mutaatio ei kuitenkaan muuta apoB:n aminohapporakennetta (12). Pilkottaessa apoB:n geenin DNA:ta XbaI-entsyymillä saadaan alleeli X2, jos geenistä löytyy entsyymin katkaisukohta ja alleeli X1, jos tätä katkaisukohtaa ei ole (13).

Norjassa (14), Englannissa (15) ja Suomessa (16) tehdyissä tutkimuksissa X2-alleelin on havaittu liittyvän seerumin suurentuneeseen kolesterolipitoisuuteen. On arvioitu, että apoB:n ja apoE:n geneettinen vaihtelu selittäisi yhteensä jopa 20 % seerumin kolesterolipitoisuuden kokonaisvaihtelusta (3, 16).

Tässä tutkimuksessa analysoitiin apoE:n ja apoB:n eri alleelikombinaatioiden yhteyttä seerumin kolesterolipitoisuuksiin 300 suomalaisen lapsen ja nuoren aineistossa.

AINEISTO JA MENETELMÄT

Tutkimuksen koehenkilöt olivat otos Lasten sepelvaltimotaudin riskitekijät -tutkimuksen (LASERI) toisen seurantavaiheen (vuosi 1986, n = 2 799) osallistujista (17,18). Otokseen kuului 9-24-vuotiaita poikia (n = 159) ja tyttöjä (n = 141), jotka oli valittu satunnaisesti Itä- (n = 165) ja Länsi-Suomesta (n = 135). Tutkimussuunnitelman ovat hyväksyneet kaikkien tutkimukseen osallistuneiden yliopistojen eettiset toimikunnat.

Verinäytteet otettiin LASERI-tutkimuksessa yön yli kestäneen paaston jälkeen EDTA-putkeen. Plasma ja verisolut erotettiin sentrifugoimalla, ja näytteet pakastettiin (plasma -70 C, verisolut -20 C). Lipidien määritystä varten otettiin toinen verinäyte, jonka annettiin hyytyä 60 minuuttia ennen seerumin erottamista.

Seerumin kokonaiskolesteroli- ja triglyseridipitoisuudet määritettiin LASERI-tutkimuksessa entsymaattisesti seerumista (Boehringer, Mannheim, Länsi-Saksa) käyttäen OLLI 3000 -automaattista analysaattoria (19). HDL-kolesteroli määritettiin samalla entsymaattisella menetelmällä sen jälkeen kun LDL ja VLDL oli saostettu dektraanisulfaatti-MgCl2:lla (20). Seerumin LDL-kolesterolipitoisuus laskettiin Friedewaldin kaavalla: LDL-kolesteroli = kokonaiskolesteroli - HDL-kolesteroli - triglyseridi/2,2 (21).

ApoE:n fenotyypit määritettiin siten, että plasmanäytteiden lipidit poistettiin etanoli-eetterisaostuksella (3:1). Näin saatu proteiinisakka liuotettiin puskuriin ja fokusoitiin isoelektrisesti polyakryyli-amidigeelillä pH-gradientissa 4-6. ApoE:n alatyypit erosivat geelillä isoelektristen pisteittensä mukaisesti. Geeliltä proteiinit siirrettiin sähkökentän avulla nitroselluloosapaperille, jossa apoE:n fenotyypit tunnistettiin kaksoisvasta-ainevärjäyksellä. Menetelmä, jonka alunperin ovat kehittäneet saksalaiset tutkijat Menzel ja Utermann (22), on kuvattu yksityiskohtaisesti Lehtimäen ym. artikkelissa (23).

ApoB:n genotyypitystä varten näytteiden DNA eristettiin 10 ml:sta verta (4). 5-10 myyg DNA:ta pilkottiin XbaI-restriktioentsyymillä käyttäen valmistajan suosittelemia olosuhteita, fraktioitiin 0,6-prosenttisessa agaroosigeelissä ja siirrettiin nitroselluloosafilttereille. Prehybridisaation jälkeen filtterit hybridisoitiin käyttäen fosforileimattua apoB-cDNA-koetinta. Filtterillä olevat apoB:n alleelit X1 (8,6 kb:n fragmentti) ja X2 (5,0 kb:n fragmentti) (kb = kilobase = 1000 emäsparia) saatiin näkyviin autoradiografisesti. Menetelmä on yksityiskohtaisesti kuvattu Aalto-Setälän ym. artikkelissa (4).

Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen mikrotietokonetta ja SAS-ohjelmistopakettia (24). ApoE:n ja apoB:n genotyyppien väliset erot seerumin lipideissä testattiin kaksisuuntaisella varianssianalyysillä.

TULOKSET

Tutkituilla nuorilla seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolipitoisuudet suurenivat asteittain apoB:n genotyyppien X1X1 < X1X2 < X2X2 ja apoE:n fenotyyppien E3/2 < E3/3 < E4/3 mukaisessa järjestyksessä (p < 0,001) (kuviot 1 ja 2). Seerumin LDL-kolesterolipitoisuus oli suurin niillä nuorilla, joilla oli perimäyhdistelmä E4/3+X2X2 ja noin 24 % pienempi niillä, joilla oli E3/2+X1X1 yhdistelmä. Seerumin HDL-kolesteroli- ja triglyseridipitoisuudet eivät eronneet merkitsevästi apoE:n fenotyyppien tai apoB:n genotyyppien välillä. ApoE:n ja apoB:n alleeli- ja genotyyppijakaumissa ei ollut itä- ja länsieroja.

POHDINTA

Suomalaisilla lapsilla ja nuorilla seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolipitoisuus lisääntyy samanaikaisesti portaittain sekä apoB:n että apoE:n genotyyppien mukaisesti. Perimäyhdistelmän E4/3+X2X2 henkilöillä on noin 24 % suuremmat seerumin kokonaiskolesteroli- ja noin kolmanneksen suuremmat LDL-kolesterolipitoisuudet kuin toisella ääripäällä eli henkilöillä, joilla yhdistelmä on E3/2+X1X1. Muiden perimäyhdistelmien henkilöt jäivät näiden kahden ryhmän väliin.

Lue myös

Aikaisemmissa tutkimuksissa on erikseen osoitettu apoE:n ja apoB:n genotyyppien vaikutus seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolipitoisuuksiin. Sen sijaan tutkimuksia, joissa olisi samanaikaisesti selvitetty näiden polymorfismien yhteisvaikutusta on julkaistu aiemmin vain muutamia. Miettinen ja työtoverit havaitsivat, että niillä suomalaisilla miehillä, joilla on geeniyhdistelmä E4+X2X2, seerumin LDL-kolesterolipitoisuus on selvästi suurempi (4,2 mmol/l) kuin niillä miehillä, joilla on perimäyhdistelmä E2+X1X1 (1,5 mmol/l) (25,26). Lisäksi alleeliyhdistelmä E4+X2 liittyy familiaalista hyperkolesterolemiaa sairastavilla potilailla erityisen suureen seerumin kolesterolipitoisuuteen (27). ApoE:n fenotyyppeihin E4/4 ja E4/3 liittyy suurentunut seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolipitoisuus ja lisääntynyt sepelvaltimotaudin riski (3,28). Tämä johtunee ainakin osittain siitä, että apoE:n geneettinen vaihtelu säätelee kolesterolin imeytymistä suolesta ja kolesterolisynteesiä maksassa (29,30). Toisaalta apoE:n eri alamuodot säätelevät apoE:tä sisältävien lipoproteiinien kiinnittymistä reseptoreihinsa ja tätä kautta postprandiaalisten kylomikronijäänteiden puhdistumaa verenkierrosta maksaan (31-33) sekä maksan LDL-reseptorien aktiviteettia ja LDL:n puhdistumaa (9).

Mekanismia, jolla apoB:n XbaI-polymorfismi vaikuttaa seerumin lipidipitoisuuksiin ei tarkkaan tunneta. On arveltu, että tämä geenilokus olisi kytkentäepätasapainossa jonkin toisen, funktionaalisesti tärkeämmän lipoproteiinimetaboliaa säätelevään apoB:n geenilokuksen kanssa (16).

Suomalaisten miesten sepelvaltimotautikuolleisuus on kansainvälisesti arvioiden suuri (34). Yhden prosentin lisäys seerumin kolesterolissa aiheuttaa sepelvaltimotautivaaran lisääntymisen noin kahdella prosentilla (35). Kun tulostemme mukaan E4/3+X2X2-perimäyhdistelmän henkilöillä on noin 24 % suuremmat kolesteroliarvot kuin yhdistelmän E3/2+X1X1 henkilöillä, tämä saattaisi merkitä sitä, että edellisten sepelvaltimotautivaara olisi noin 48 % suurempi kuin jälkimmäisten. Tämä on kuitenkin vielä toteen näyttämättä. ApoE:n ja apoB:n alleelijakaumat Itä- ja Länsi-Suomessa ovat samanlaiset; näin ollen tutkitut polymorfismit eivät selitä itäsuomalaisten noin 50 % suurempaa sepelvaltimotautikuolleisuutta länsisuomalaisiin nähden (36).

PERIMÄ JA RAVITSEMUS SÄÄTÄVÄT SUOMALAISTEN KOLESTEROLIARVOT

Tutkimuksen tulokset osoittavat, että suomalaisilla lapsilla ja nuorilla apoB:n ja apoE:n polymorfismien yhteisvaikutus on keskeinen seerumin kokonais- ja LDL-kolesterolipitoisuuden säätelijä ja että perimällä on ravitsemustekijöiden lisäksi tärkeä osuus suomalaisten kolesterolitasojen säätelijänä.

KIRJALLISUUTTA

Tulokset on julkaistu aikaisemmin artikkelissa Lehtimäki ym. Association of apolipoprotein E and B polymorphism with serum lipids. Ann Med 1991;23:657-662.

Kirjoittajat

Kirjoittajat
Terho Lehtimäki
LT, tutkija
Tampereen yliopisto, biolääketieteen laitos
Kimmo Kontula
apulaisprofessori
HYKS, II sisätautien klinikka
Katriina Aalto-Setälä
LT
Helsingin yliopisto, biotekniikan instituutti
Kimmo Porkka
LT, apulaislääkäri HYKS, III sisätautien klinikka
Christian Ehnholm
professori
Kansanterveyslaitos
Jorma Viikari
apulaisprofessori TYKS, sisätautien klinikka
Tapio Nikkari
professori
Tampereen yliopisto, biolääketieteen laitos


Kirjallisuutta
1
Stamler J, Wentworth D, Neaton JD. Is relationship between serum cholesterol and risk of premature death from coronary heart disease continuous and graded? Findings in 356222 primary screenees of the Multiple Risk Factor Intervention Trial (MRFIT). JAMA 1986;256:2823-2828.
2
Ehnholm C, Lukka M, Kuusi T ym. Apolipoprotein E polymorphism in the Finnish population: gene frequencies and relations to lipoprotein concentrations. J Lipid Res 1986;27:227-235.
3
Davignon J, Gregg RE, Sing CF. Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis. Arteriosclerosis 1988;8:1-21.
4
Aalto-Setälä K, Viikari J, Åkerblom HK, Kuusela V ym. DNA polymorphisms of the apolipoprotein B and A-I/C-III genes are associated with variations of serum low density lipoprotein cholesterol level in childhood. J Lipid Res 1991;32:1477-1487.
5
Mahley RW. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 1988;240:622-630.
6
Knott TJ, Pease RJ, Powell LM ym. Complete protein sequence and identification of structural domains of human apolipoprotein B. Nature 1986;323:734-738.
7
Yang C-Y, Chen S-H, Gianturco SH ym. Sequence, structure, receptor-binding domains and internal repeats of human apolipoprotein B-100. Nature 1986;323:738-742.
8
Olofsson S-O, Bjursell G, Boström K ym. Apolipoprotein B: structure, biosynthesis and role in the lipoprotein assembly process. Atherosclerosis 1987;68:1-17.
9
Brown MS, Herz J, Kowal RC, Goldstein JL. The low-density lipoprotein receptor-related protein: double agent or decoy? Curr Opin Lipidol 1991;2:65-72.
10
Utermann G, Hees M, Steinmetz A. Polymorphism of apolipoprotein E and occurrence of dysbetalipoproteinaemia in man. Nature 1977;269:604-607.
11
Zannis VI, Just PW, Breslow JL. Human apolipoprotein E isoprotein subclasses are genetically determined. Am J Hum Genet 1981;33:11-24.
12
Ludwig EH, Blackhart BD, Pierotti VR ym. DNA sequence of the human apolipoprotein B gene. DNA 1987;6:363-372.
13
Law A, Powell LM, Brunt H, Knott TJ ym. Common DNA polymorphism within coding sequence of apolipoprotein B gene associated with altered lipid levels. Lancet 1986;i:1301-1303.
14
Berg K. DNA polymorphism at the apolipoprotein B locus is associated with lipoprotein level. Clin Genet 1986;30:515-520.
15
Talmud PJ, Barni N, Kessling AM ym. Apolipoprotein B gene variants are involved in the determination of serum cholesterol levels: a study in normo- and hyperlipidaemic individuals. Atherosclerosis 1987;67:81-89.
16
Kontula K ja Aalto-Setälä K. Geenit ja kolesteroli. Duodecim 1988;104:1824-1837.
17
Åkerblom HK, Uhari M, Pesonen E ym. Cardiovascular risk in young Finns. Ann Med 1991;23:35-39.
18
Porkka K. Factors influencing tracking of serum lipid values in children and young adults. A 9-year follow-up study. Annales Universitatis Turkuensis ser D 1991;83:1-159.
19
Wahlefeld AW. Triglycerides. Determination after enzymatic hydrolysis. Kirjassa: Bergmyer HV, toim. Methods of Enzymatic Analysis. New York: Academic Press, 1974;1831.
20
Kostner GM. Enzymatic determination of cholesterol in high-density lipoprotein fractions prepared by polyanion precipitation. Clin Chem 1976;22:695.
21
Friedewald WT, Levy RI, Fredrickson DS. Estimation of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without use of the preparative ultracentrifuge. Clin Chem 1972;18:499-502.
22
Menzel H-J, Utermann G. Apolipoprotein E phenotyping from serum by Western blotting. Electrophoresis 1986;7:492-495.
23
Lehtimäki T, Moilanen T, Viikari J ym. Apolipoprotein E phenotypes in Finnish youths: a cross-sectional and 6-year follow-up study. J Lipid Res 1990;31:487-495.
24
SAS Institute Inc. SAS Procerudes Guide. Release 6.03 ed. Cary, NC: SAS Institute Inc, 1988
25
Miettinen T. Impact of apoE phenotype on the requlation of cholesterol metabolism. Ann Med 1991;23:181-186.
26
Kesäniemi A, Kontula K, Miettinen T, Tikkanen M. Lipoproteiinit, perintötekijät ja suomalainen sepelvaltimotauti. Duodecim 1991;107:1203-1216.
27
Gylling H, Aalto-Setälä K, Kontula K, Miettinen T. Serum low density lipoprotein cholesterol level and cholesterol absorption efficiency are influenced by apolipoprotein B and E polymorphisms and by the FH-Helsinki mutation of low density lipoprotein receptor gene in familial hypercholesterolemia. Arteriosclerosis and Thrombosis 1991;11:1368-1375.
28
Kuusi T, Nieminen MS, Ehnholm C ym. Apolipoprotein E polymorphism and coronary artery disease - increased prevalence of apolipoprotein E-4 in angiographically verified coronary patients. Arteriosclerosis 1989;9:237-241.
29
Kesäniemi YA, Ehnholm C, Miettinen TA. Intestinal cholesterol absorption efficiency in man is related to apolipoprotein E phenotype. J Clin Invest 1987;80:578-581.
30
Gylling H, Miettinen T. Cholesterol absorption and synthesis related to low density lipoprotein metabolism during varying cholesterol intake in men with different apoE phenotypes. J Lipid Res 1992;33:1361-1371.
31
Weisgraber KH, Innerarity TL, Mahley RW. Abnormal lipoprotein receptor-binding activity of the human E apoprotein due to cysteine - arginine interchange at a single site. J Biol Chem 1982;257:2518-2521.
32
Weintraub MS, Eisenberg S, Breslow JL. Dietary fat clearance in normal subjects is regulated by genetic variation in apolipoprotein E. J Clin Invest 1987;80:1571-1577.
33
Nikkilä M, Solakivi T, Lehtimäki T ym. Sepelvaltimotauti ja seerumin lipidit rasvarasituksen yhteydessä. Duodecim 1993;109:380-385.
34
Pisa Z, Uemura K. International differences in developing improvements in cardiovascular health. Ann Med 1989;21:193-197.
35
Lipid Research Clinics Program. The Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial results. II. The relationship of reduction in incidence of coronary heart disease to cholesterol lowering. JAMA 1984;251:365-374.
36
Reunanen A, Aromaa A, Pyörälä K. Sepelvaltimotauti ja sen vaaratekijät Suomessa. Duodecim 1991:107:1187-1200.
Lääkäriliitto Fimnet Lääkärilehti Potilaanlaakarilehti Lääkäripäivät Lääkärikompassi Erikoisalani Lääkäri 2030