Geenimonistukseen perustuvat pikamenetelmät tuberkuloosin diagnostiikassa

Sairastuvuus tuberkuloosiin on vuosikymmeniä jatkuneen vähenemisen jälkeen kääntynyt 1980-luvun lopulta maailmanlaajuiseen kasvuun. Myös Suomessa tuberkuloositapaukset ovat vähentyneet aina viime vuosiin asti, mutta nyt on saatu viitteitä siitä, että vähentyminen on pysähtynyt. TAYS:n kliinisen mikrobiologian yksikössä on pidetty vuodesta 1982 rekisteriä Pirkanmaan sairaanhoitopiirin alueella löydetyistä uusista tautitapauksista. Pirkanmaan alueelta löydetyt uudet tapaukset vastaavat noin 10 %:a koko maan luvuista eikä niiden perusteella voi tehdä suoria päätelmiä Suomen tuberkuloositilanteesta, mutta vuonna 1993, usean vuoden tasaisen laskun jälkeen, viljelypositiivisten näytteiden ja uusien tuberkuloosipotilaiden määrä kääntyi kasvuun. Vuonna 1994 uusien tuberkuloosipotilaiden määrä ei lisääntynyt, mutta vuoden 1995 alkupuoli osoittaa jälleen lievää uusien tautitapauksien lisääntymistä. Lisäksi merkittävänä erityispiirteenä on havaittu, että TAYS:iin tuberkuloosiviljelyyn lähetetyistä näytteistä löytyy aikaisempaa selvästi useammin mikrobeja, jotka ovat Mycobacterium tuberculosiksen sukuisia lajeja, jotka tunnetaan ryhmänimellä atyyppiset mykobakteerit. Syitä muutokseen ei tiedetä, mutta parantunut diagnostiikka ja mykobakteeri-infektioiden riskiryhmien eli pakolaisten sekä HIV-infektio- ja immunosuppressiopotilaiden määrän kasvu voivat osittain selittää sen.

M. tuberculosiksen laboratoriodiagnostiikka on perustunut tuberkuloosivärjäykseen ja viljelyyn joko kiinteällä tai nestemäisellä ravintoalustalla. Värjäyksen herkkyys on rajallinen, mutta sitä pidetään edelleen nopeana ja spesifisenä primäärinäytteiden seulontatestinä (1,2). Mykobakteerien osoittamisessa perinteisillä viljelymenetelmillä on ongelmana mikrobien erittäin hidas kasvu. Viljely BACTEC-järjestelmällä on selvästi nopeuttanut diagnostiikkaa, mutta edelleen positiivisen viljelytuloksen saaminen saattaa kestää 3-4 viikkoa ja negatiivinen tulos vaatii aina vähintään 6 viikon viljelyn.

Uusien geenimonistustekniikoihin perustuvien menetelmien on toivottu merkittävästi nopeuttavan ja tarkentavan tuberkuloosin laboratoriodiagnostiikkaa. Menetelmät perustuvat M. tuberculosikselle ominaisen geeniaineksen, DNA-sekvenssin tai RNA-sekvenssin monistamiseen näytteestä polymeraasiketjureaktiolla (PCR) tai RNA-amplifikaatiolla miljoonakertaisesti ennen osoitusreaktiota. Geenitekniikoiden teoreettisena etuna perinteisiin menetelmiin verrattuna on erinomainen spesifisyys, ja lisäksi geeniaineksen monistaminen voi parantaa huomattavasti osoitusreaktion herkkyyttä. Erilaisia PCR-menetelmiä onkin jo käytetty tuberkuloosibakteerin osoituksessa (3,4,5). Omatekoisten PCR-sovellutusten käyttö on kuitenkin Yhdysvalloissa asetettu kyseenalaiseksi, sillä äskettäinen tuberkuloosilaboratorioiden ja PCR-menetelmien laaduntarkkailukierros osoitti, että menetelmien herkkyys vaihtelee suuresti ja on huonoimmillaan alle 50 % (6). Standardoitujen ja luotettavien kaupallisten tuberkuloosin pikaosoitusmenetelmien tarve onkin ilmeinen.

M. tuberculosiksen osoittamiseen suoraan näytteestä ilman viljelyä on tällä hetkellä tarjolla kaksi spesifistä kaupallista sovellutusta, joilla tuberkuloosibakteeri voidaan osoittaa nopeimmillaan näytteenottopäivänä. Toinen on RNA-amplifikaatioon perustuva sovellutus (Gen-Probe Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test, AMTD) ja toisessa käytetään PCR-menetelmää (Roche Amplicor Mycobacterium Direct Test, Amplicor PCR).

OMAT KOKEMUKSET PIKAMENETELMIEN KÄYTÖSTÄ

TAYS:n kliinisen mikrobiologian yksikössä tehdyssä tutkimuksessa verrattiin uusia pikamenetelmiä perinteisiin tuberkuloosivärjäykseen ja viljelyyn (7). Tutkimuksessa oli mukana 256 näytettä (132 ysköstä, 17 keuhkohuuhtelunäytettä ja 107 bronkoskopianäytettä) 243 potilaasta.

Viljelypositiiviseksi tulkittiin BACTEC-pullossa tai Löwenstein-Jensenin viljelyputkella kasvava näyte, joka voitiin varmistaa värjäyksellä ja jolle saatiin suoritettua kannanmääritys Accu-Probe-tekniikalla. Viljelypositiivisia näytteitä oli 33, ja näistä 26 näytteessä kasvoi M. tuberculosis. Seitsemän näytettä tunnistettiin kuuluvaksi M. avium -ryhmään (neljä M. aviumia ja kolme M. intracellularea). Atyyppiset mykobakteerit antoivat negatiivisen tuloksen geenimonistusmenetelmillä eikä niitä otettu mukaan lopullisiin vertailutuloksiin.

Yhteensä 26 näytettä 18 potilaasta oli viljelyssä positiivisia. Näistä näytteistä kaksi oli värjäyksessä negatiivisia, mutta geenimonistusmenetelmillä positiivisia. Kolme viljelypositiivista näytettä oli negatiivisia värjäyksessä ja geenimonistusmenetelmillä tutkittuina. Verrattuna viljelyyn värjäyksen herkkyys oli 80,8 %, AMTD:n 84,6 % ja Amplicor PCR:n 84,6 %. Menetelmien spesifisyydet olivat 99,1 %, 98,7 % ja 99,1 %.

Yhteensä neljän potilaan neljästä viljelyssä negatiivisesta näytteestä saatiin positiivisen tulos jollain muulla osoitusmenetelmällä. Potilaiden sairauskertomukset käytiin läpi, ja lopulliset tulokset perustuvat sairauskertomuksen tietoihin, aiempiin laboratoriolöydöksiin ja kliinisiin päätöksiin lääkehoidon aloittamisesta. Kahdella potilaalla, joiden näyte oli todettu positiiviseksi kummallakin geenimonistusmenetelmällä, oli aiempi tuberkuloosidiagnoosi ja heille oli aloitettu tuberkuloosilääkitys näytteen-oton jälkeen. Yhden potilaan näyte oli positiivinen ainoastaan AMTD-menetelmällä. Yhtä värjäyspositiivista löydöstä ei voitu vahvistaa kliinisillä tiedoilla.

Kun ristiriitaiset tulokset oli selvitetty, laskettiin vertailutulokset uudelleen; tulokset on esitetty taulukossa 1. Kummankin geenimonistusmenetelmän spesifisyys oli 100 % ja herkkyydeltään ne olivat samaa luokkaa perinteisten viljelymenetelmien kanssa.

Uusien menetelmien analyyttinen toistettavuus osoittautui hyväksi ja niiden käyttö kliiniseen mikrobiologiaan erikoistuneessa laboratoriossa onnistui helposti. Geenimonistusreaktioiden kontaminaatioherkkyys edellyttää kuitenkin laboratoriossa erityisiä tilajärjestelyjä ja henkilökunnan perusteellista kouluttamista. Tämän tutkimuksen aikana ei havaittu näytteiden tai monistettujen reaktiotuotteiden aiheuttamia kontaminaatio-ongelmia. Gen-Proben AMTD oli jonkin verran nopeampi menetelmä, sillä sen vaatima analyysiaika on noin viisi tuntia, kun Amplicor PCR:n suorittamiseen kuluu noin seitsemän tuntia.

POHDINTA

Perinteisen viljelyn herkkyys tuberkuloosibakteerin osoittamisessa on hyvä ja BACTEC-menetelmällä suoritettu viljely on myös nopeuttanut diagnostiikkaa. BACTEC-viljely ei kuitenkaan ole aina luotettava tutkittaessa värjäysnegatiivisia näytteitä (1), ja tuberkuloosiviljelyn "kultainen standardi" onkin tällä hetkellä BACTEC- ja Löwenstein-Jensenin putkiviljelyn yhdistelmä (1,2). Oman kokemuksemme perusteella yhdistetyllä viljelykäytännöllä saavutettiin 90 %:n herkkyys.

Happovärjäys on yksinkertainen, nopea ja halpa menetelmä, jonka spesifisyys mykobakteereille on hyvä, mutta herkkyys on rajallinen. Auramiinifluoresenssivärjäys on perinteistä Ziehl-Neelsenin värjäystä herkempi ja soveltuu siten näytteiden seulontaan. Atyyppisten mykobakteerien jatkuva lisääntyminen näytemateriaalissa rajoittaa kuitenkin positiivisten värjäystulosten arvoa. Tässä aineistossa oli mukana seitsemän värjäys- ja viljelypositiivista näytettä (32 % värjäyspositiivisista), jotka kannanmäärityksessä osoittautuivat atyyppisiksi mykobakteereiksi. Näistä näytteistä saatiin negatiivinen tulos geenimonistusmenetelmillä.

Gen-Proben AMTD perustuu M. tuberculosiksen ribosomaalisen RNA:n monistamiseen ja osoittamiseen. Menetelmän ensimmäisessä vaiheessa käänteinen transkriptaasi muodostaa RNA:sta komplementaarisen DNA:n, jota mallina käyttäen RNA-polymeraasi kopioi yksinauhaisia RNA-molekyylejä. Miljoonakertaisesti monistuneet RNA-molekyylit mitataan samalla RNA-DNA-hybridisaatiomenetelmällä, jota käytetään viljelypositiivisten näytteiden kannanmäärityksessä. Menetelmän herkkyyden kannalta AMTD:n teoreettisena etuna on RNA:n monistaminen, sillä yhdessä bakteerissa on noin 2 000 ribosomaalisen RNA:n kopiota yhtä DNA-kopiota kohti. Gen-Proben RNA-amplifikaatiota on käytetty jo noin kahden vuoden ajan ja se on osoittautunut herkäksi menetelmäksi. Omat tuloksemme ovat samansuuntaisia kuin muissa tutkimuksissa (3,8,9,10).

Rochen PCR-menetelmä perustuu M. tuberculosiksen 16S ribosomaalisen RNA-geenin 584 emäsparisekvenssin monistamiseen polymeraasiketjureaktiolla. Biotiinilla leimatut monistetut nukleotidiketjut mitataan entsyymi-immunologisella tekniikalla. Amplicor PCR:n herkkyys oli omassa tutkimuksessamme samaa suuruusluokkaa kuin Gen-Proben AMTD:nkin, mutta sillä ei löytynyt yhtä AMTD:ssä positiivista näytettä.

Värjäyksessä negatiiviset mutta myöhemmin viljelyssä positiiviseksi osoittautuvat näytteet ovat tuberkuloosidiagnostiikan ongelmanäytteitä. Uudet menetelmät löysivät tässä aineistossa kaksi viidestä värjäysnegatiivisesta viljelypositiivisesta näytteestä ja lisäksi kolme viljelyssä negatiivista todellista positiivista näytettä. Uusista menetelmistä tällaisten ongelmanäytteiden selvittelyssä saatava hyöty vaatii jatkoselvittelyä laajempia potilasaineistoja käyttäen. Viljelypositiivisista näytteistä geenimonistusmenetelmillä saadut negatiiviset tulokset saattavat selittyä entsymaattisten monistusreaktioiden estäjillä, joiden aiheuttamia ongelmia on kuvattu erilaisista PCR-sovellutuksista (11,12,13). Lisäksi bakteerien epätasainen jakaantuminen vähän bakteereita sisältävissä näytteissä saattaa aiheuttaa eroja menetelmävertailussa.

Uudet geenimonistukseen perustuvat tuberkuloosin osoitusmenetelmät ovat keskenään herkkyydeltään samanveroisia ja verrattavissa perinteisiin menetelmiin. Menetelmät tarjoavat nopean ja spesifisen vaihtoehdon tuberkuloosin laboratoriodia-gnostiikassa. Erityisen perusteltua niiden käyttö voisi olla värjäyspositiivisten näytteiden jatkoanalysoinnissa, jolloin saataisiin nopeasti selville, onko kyseessä tuberkuloosi vai atyyppinen mykobakteeri. Reagenssien hinta sekä tuberkuloosin esiintyvyydessä ja lääkeresistenssissä tapahtuva kehitys vaikuttavat pikatestien lopulliseen asemaan tuberkuloosin diagnostiikassa.

KIRJALLISUUTTA