Geenimonistusmenetelmä sukupuoliteitse tarttuvan klamydian osoittamisessa - vaativa laboratoriotutkimus

Geenimonistusmenetelmät ovat suurelta osin korvanneet viljelyn ja entsyymi-immunologiset menetelmät sukupuoliteitse tarttuvan klamydian laboratoriodiagnostiikassa. Syinä tähän muutokseen ovat olleet geenimonistusmenetelmien selvästi muita menetelmiä parempi herkkyys ja se, että näytteeksi tähän tutkimukseen sopii potilaan antama ensivirtsanäyte (1). Käytössä on jo kolme kaupallista geenimonistukseen perustuvaa sovellusta, polymeraasiketjureaktioon (PCR, polymerase chain reaction) perustuva sovellus (Cobas Amplicor, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Sveitsi), ligaasiketjureaktioon (LCR, ligase chain reaction) perustuva sovellus (LCx, Abbott laboratories, Chicago, Illinois, USA) ja transkriptiovälitteiseen monistukseen perustuva sovellus (AMP-CT, Gen-Probe Inc., San Diego, Kalifornia, USA). Kaikkien geenimonistusmenetelmien herkkyys ja spesifisyys ovat selvästi paremmat kuin antigeeninosoitusmenetelmien, ja herkkyys on selvästi parempi ja spesifisyys samaa luokkaa kuin viljelyn (2,3,4,5).

Geenimonistusmenetelmien herkkyyttä heikentää vaikeasti ennustettavissa oleva monistusreaktioiden estyminen, jota esiintyy potilasnäytteissä vaihtelevasti (1). Tulos runsaastikin klamydiapartikkeleita sisältävästä näytteestä saattaa sen vaikutuksesta jäädä negatiiviseksi. Ongelman ratkaisua vaikeuttaa se, että estymisen mekanismeja ei tunneta. Rochen Cobas Amplicorissa on sisäinen tarkistusjärjestely, jolla tällainen näyte paljastuu ja voidaan käsitellä uudelleen. Abbottin LCR-sovelluksessa tällaista tarkistusta ei ole. Kaikkien geenimonistusmenetelmien yhteydessä on raportoitu vääriä positiivisia tuloksia 0-22 % kaikista positiivisista tuloksista (0-3 % kaikista tuloksista) (3,4,6).

Tässä tutkimuksessa verrattiin PCR- ja LCR-menetelmiä naispotilaiden virtsanäytteiden tutkimisessa kiinnittäen erityistä huomiota reaktioiden estymisestä johtuviin vääriin negatiivisiin tuloksiin. Todellisten positiivisten löytämiseksi potilailta tutkittiin virtsanäytteiden lisäksi myös kohdun kaulakanavanäytteet. Koska tutkimusaineistoista saadut tulokset ovat usein muuta kuin käytännön laboratorioissa saadut, tutkimus haluttiin toteuttaa osana kliinisen mikrobiologian laboratorioiden rutiinianalytiikkaa. Siten näytteet tutkittiin rutiininäytteinä kahdessa LCR-menetelmää käyttävässä laboratoriossa ja rinnakkaisnäytteet PCR-menetelmää käyttävässä laboratoriossa, jossa kohdun kaulakanavanäytteistä tehtiin myös klamydiaviljely.

AINEISTO JA MENETELMÄT

Tutkittava potilasjoukko koostui naispotilaista, jotka hakeutuivat Kotkan tai Jyväskylän kaupungin terveyskeskusten sukupuolitautien vastaanotolle klamydiainfektioon viittaavin oirein tai sen tartunnan epäilyn vuoksi. Potilailta otettiin klamydiatutkimusta varten ensivirtsanäyte ja satunnaisessa järjestyksessä kaksi tikkunäytettä kohdun kaulakanavasta. Näytteet toimitettiin Kymenlaakson ja Keski-Suomen keskussairaalan mikrobiologian laboratorioihin jatkokäsittelyä varten. Laboratorioissa ensivirtsanäyte jaettiin kahteen osaan, joista toinen pakastettiin -70 C:een ja toinen tutkittiin laboratorion käyttämällä LCR-menetelmällä klamydian osoittamiseksi. Tikkunäytteistä toinen tutkittiin yhdessä virtsanäytteen kanssa ja toinen pakastettiin -70 C:een. Pakastetut näytteet lähetettiin 10-20 näytteen erissä edelleen TAYS:n kliinisen mikrobiologian yksikköön, jossa ne tutkittiin PCR-sovelluksella (Cobas Amplicor) ja tikkunäyte myös viljelyllä.

Ligaasiketjureaktioon perustuva klamydian osoitus tehtiin Kymenlaakson ja Keski-Suomen keskussairaalan mikrobiologian laboratorioissa kaupallisella testisovelluksella testin valmistajan ohjeiden mukaan. TAYS:n mikrobiologian yksikön käyttämä polymeraasiketjureaktioon perustuva menetelmä oli myös kaupallinen sovellus, ja sitä käytettiin testin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Klamydiaviljely tapahtui McCoy-soluviljelmissä (7). Potilas määriteltiin klamydiapositiiviseksi, jos viljelyn tulos oli positiivinen tai vähintään toinen näytteistä oli positiivinen sekä LCR- että PCR-tutkimuksessa.

TULOKSET

Potilaita kertyi yhteensä 309, Kotkan terveyskeskuksesta 151 ja Jyväskylästä 158. Klamydiainfektion esiintyvyys Kotkan aineistossa oli 7,3 % (11/151) ja Jyväskylässä 6,3 % (10/158); keskimäärin 6,8 %. Vähintään yhdellä menetelmällä saatiin positiivinen tulos 24 potilaalta (taulukko 1). Suurin osa potilaista (18/24) todettiin positiiviseksi kaikilla kolmella menetelmällä molemmista näytetyypeistä. Positiivisiksi määritellyistä potilaista LCR-menetelmällä saatiin kaksi ja viljelyssä niin ikään kaksi väärää negatiivista tulosta. Negatiivisiksi määritellyistä potilaista LCR-menetelmällä saatiin kolme virtsanäytettä väärin positiiviseksi.

Kaikki LCR-menetelmällä virtsanäytteestä saadut väärät positiiviset (3/24) ja väärä negatiivinen (1/286) tulivat esille toisessa menetelmää käyttävistä laboratorioista. Toisessa laboratorioista saatiin lisäksi yksi kohdun kaulakanavanäyte LCR:llä väärin negatiiviseksi. PCR-menetelmällä tutkittuna yksi virtsanäyte jäi primaarimäärityksessä väärin negatiiviseksi (oli uusintatestissä kuitenkin positiivinen) ja yhden tulos sijoittui positiivisen ja negatiivisen rajalle. Lisäksi neljässä näytteessä todettiin reaktion estyminen, ja näistä yhdestä saatiin laimennettuna oikea positiivinen tulos.

POHDINTA

Tutkimuksen alkuperäisenä tarkoituksena oli selvittää reaktion estymisen merkitystä ligaasiketjureaktioon perustuvassa kaupallisessa klamydian osoitustestissä (LCx). Polymeraasiketjureaktioon perustuvassa vastaavassa testissä (Cobas Amplicor) on sisäinen tarkistusjärjestely, jolla ketjureaktion estyminen voidaan tunnistaa. Abbotin LCR-sovelluksessa tällaista tarkistusta ei ole. Tutkimusten perusteella kyseisessä PCR-sovelluksessa reaktion estymistä esiintyy 3-14 %:ssa virtsanäytteistä (2,8,9). Nyt tutkitussa aineistossa tällaisia näytteitä oli vain neljä (1,3 %). Näistä vain yksi osoittautui ohjeen mukaan laimennettuna positiiviseksi eikä PCR-testiä haitannut estyminen aiheuttanut väärää negatiivista tulosta LCR-testissä. LCR-menetelmällä tehdyissä tutkimuksissa väärien negatiivisten osuus on ollut 3-6 % (4,10,11,12). Tarkistusjärjestelyn puuttuessa ei voida varmuudella sanoa, kuinka suuri osa näistä on johtunut juuri reaktion estymisestä. Tässä tutkimuksessa tuli esille vain yksi tästä johtuva väärä negatiivinen LCR-tulos. Reaktion estymisen tiheys voi siten vaihdella potilasaineiston mukaan. Väärät negatiiviset tulokset ovat mahdollisia kummassakin sovelluksessa, mutta LCR-menetelmällä niitä ei voida todeta.

Väärien positiivisten tulosten osuus geenimonistussovelluksilla tehdyissä tutkimuksissa klamydian osoittamiseksi on 0-22 % positiivisista tuloksista ja 0-3 % kaikista tuloksista (3,4,6). Tässä tutkimuksessa saatiin kolme väärää positiivista yhteensä 24 positiivisesta (noin 12 % kaikista positiivisista tuloksista ja 1 % kaikista tuloksista), mikä kertoo menetelmän spesifisyyden olevan kansainvälisen mittapuun mukaan keskiarvotasoa. Jos menetelmällä seulottaisiin seksuaalisesti aktiivisessa iässä olevaa väestönosaa, jossa klamydian kantajuus on arvioiden mukaan 3 %, olisi joka neljäs positiivinen tulos väärä.

Yllättävää tuloksissa oli virheellisten LCR-tulosten kasautuminen toiseen kahdesta samantasoisesta laboratoriosta. Syytä eroon laboratorioiden tuloksissa on vaikea löytää. On kuitenkin selvää, että havainto on muistutus uudentyyppisen menetelmän käyttöön sisältyvistä sudenkuopista. Yksi tällainen on menetelmien suuri herkkyys: kummankin tässä tutkimuksessa mukana olleen geenimonistusmenetelmän on osoitettu tunnistavan positiiviseksi näytteen, jossa on vain kolme klamydiapartikkelia (13). Niinpä pienikin pisara positiivista näytettä joutuessaan negatiiviseen näytteeseen saattaa johtaa väärään positiiviseen tulokseen.

Geenimonistusmenetelmät ovat kaupallisina sovelluksinakin vaativia laboratoriomenetelmiä, joiden luotettava käyttö vaatii henkilökunnalta ammattikoulutusta ja hyvää perehtymistä tehtävään. Ensimmäistä kertaa mikrobiologian historiassa olemme tekemisissä menetelmien kanssa, joiden herkkyys on suurempi kuin viljelymenetelmän. Siksi varmistustestiä näille menetelmille ei ole (testin toistaminen ei ole varmistamista). Niinpä sekä laboratorio että hoitava lääkäri joutuvat toimimaan testien suorituskyvyn armoilla, ja tämä korostaa laboratorioiden pätevyydelle asetettavia vaatimuksia.