Fluoresenssivärjäykset EIA-tuloksen varmentajina klamydiadiagnostiikassa

Chlamydia trachomatiksen aiheuttaman sukupuolitaudin diagnostiikassa käytettyjä testejä ovat viljely, suora immunofluoresenssikoe (IF), entsyymi-immunologinen määritys (EIA), liuskakokeet sekä nukleiinihapon osoitusmenetelmät (1,2,3).

Suomessa yleisin tapa osoittaa Chlamydia trachomatis näytteistä on esiseulonta EIA:lla ja tuloksen varmennus IF:lla. Tämän menettelytavan virheistä on varoitettu usein (1,2,3). Erityisesti on kehotettu varmistamaan kaikki selvästi negatiivisesta arvosta poikkeavat absorbanssiarvot, vaikka ne olisivatkin positiivisen rajan alapuolella.

Nyt esiteltävässä työssä tarkasteltiin kyseisiä "harmaan alueen" näytteitä, joiden absorbanssiarvo EIA:ssa poikkesi selvästä negatiivisesta, mutta jotka testin valmistajan mukaan olivat negatiivisia.

AINEISTO JA MENETELMÄT

Tutkimusaineistona oli 1 890 laboratorioon tullutta, peräkkäistä Chlamydia trachomatis -näytettä. Näytteet olivat valikoimattomia ja peräisin terveyskeskuksista, yksityislaboratorioista sekä keskussairaalasta. Seulontatestinä käytettiin Abbottin Chlamydiazyme EIA-testiä. Tulokset varmennettiin Syvan IF-testillä. Positiivisen EIA-tuloksen rajaksi valittiin absorbanssiarvo 0,100 ja alimmaksi IF-varmistukseen otettavan negatiivisen tuloksen rajaksi absorbanssiarvo 0,030. Harmaaksi alueeksi katsottiin tässä tutkimuksessa absorbanssiarvojen 0,030-0,099 väliin jäävät tulokset.

Kaikki näytteet, joiden EIA-arvo oli 0,030 tai suurempi, tutkittiin IF:lla sekä akridiinioranssivärjäyksellä.

Akridiinioranssi on fluoresenssiväri, joka värjää bakteerit, hiivan, parasiitit ja leukosyyttien tumat oransseiksi (4). Mikroskopoitaessa käytettiin samoja suodattimia kuin tarkasteltaessa IF-näytteitä. Värjäyksellä ei etsitty yksittäisiä klamydiapartikkeleita eikä -inkluusioita, koska niitä ei voida löytää tällä menetelmällä riittävän luotettavasti muiden bakteerien voimakkaan kontaminaation vuoksi. Sen sijaan sillä pyrittiin selvittämään, mitä muita patogeeneja näytteissä oli klamydian lisäksi.

TULOKSET

Tutkituista 1 890 näytteestä 142 (7,5 %) oli EIA- tai IF-positiivisia ja 1 748 negatiivisia.

EIA-negatiivisista näytteistä oli harmaalla alueella 146, ja näistä 26 oli IF-kokeen mukaan positiivisia (taulukko 1). Väärät EIA-positiiviset kasaantuivat odotetusti lähelle raja-arvoa 0,100 siten, että arvon 0,049 alapuolella oli vain muutama näyte. Toisaalta, lähellä EIA-arvoa 0,030 olevista näytteistä todettiin IF-osituksessa 500-kertaisella suurennuksella jopa viisikin klamydiapartikkelia.

EIA-testin mukaan positiivisia oli 136 näytettä, joista 116 varmentui IF:lla positiivisiksi (taulukko 1). Osa negatiivisista näytteistä oli EIA-testissä lähellä absorbanssiarvoa 2,0.

Mikroskopoiduista näytteistä (EIA:n absorbanssilukema yli 0,030) oli positiivisia yhteensä 142/282 (50,3 %).

Akridiinioranssivärjäys osoittautui tarpeelliseksi ja helpoksi. Tutkittavasta EIA-näytteestä suspensoitiin samanaikaisesti toiselle rengaslasille IF-näyte ja toiselle akridiinioranssinäyte. Jälkimmäiselle näytteelle sopiva inkubaatioaika oli 2 minuuttia, mutta kokeiltaessa viisikin minuuttia antoi hyvän tuloksen. Värjäys on helppo tulkita, nopea tehdä ja antaa tarpeellista lisäinformaatiota siitä, miksi IF-näyte on sotkuinen tai miksi EIA- ja IF-tutkimusten tulokset eroavat. Se ei sovi Chlamydia trachomatiksen toteamiseen.

Taulukossa 2 on esitetty niiden näytteiden värjäystulokset, joissa IF:lla ei voitu osoittaa klamydiapartikkeleita. Erityisesti akridiinioranssivärjäyksessä liian paksut näytteet olivat IF-negatiivisia. Niissä oli usein myös runsaasti bakteerimassaa. Näiden näytteiden fokusointi akridiinioranssilla oli näytteen paksuuden vuoksi hankalaa, vaikka IF-värjäyksessä näytteissä ei ollut erikoista. Tämä johtuu siitä, että IF-värjäyksessä on pyritty poistamaan häiriötekijät siten, että klamydiat näkyvät paremmin. Kuvista 1-3 näkyy akridiinioranssivärjäyksellä todettuja sivulöydöksiä sekä paksujen näytteiden fokusoinnin hankaluus.

POHDINTAA

Tutkimuksemme osoitti oikeaksi nykyisen Chlamydia trachomatiksen diagnostiikassa omaksutun suosituksen, että kaikki poikkeavat EIA-tulokset on varmennettava. Tässä työssä ei selvinnyt, moniko EIA-negatiivinen (lukema alle 0,030) näyte todellisuudessa oli positiivinen ja olisiko nämä voitu todeta IF:lla.

Tämän työn kanssa samansuuntaisia tuloksia ovat saaneet Chan ym. (5), jotka käyttivät toisen valmistajan EIA-testiä (Syva) ja samaa IF-testiä kuin tässä tutkimuksessa. He määrittivät harmaan alueen pienemmäksi kuin me omassa tutkimuksessamme. Kellogg ym. (6) käyttivät Chlamydiazyme-EIA-testiä ja harmaalla alueella (lukema 0,030-0,099) oli 202 näytettä. Jatkotutkimuksena he käyttivät "bloking-testiä", ja tämän positiiviset tulokset he varmistivat IF:lla. Näytteistä blokeerautui 66, joista 34 oli positiivisia IF-kokeessa. Tämä käytäntö ei ole suomalaisen suosituksen mukainen.

Tulosten informaatio riippuu siitä, mitä vertailulukuja käytetään. Vertailulukuna voidaan käyttää näytteiden kokonaismäärää 1 890, mikroskopoitavien näytteiden määrää 282, tai harmaan alueen näytteiden määrää.

Työmäärää arvioitaessa, kun positiivisen EIA-lukeman rajana käytettiin arvoa 0,100, IF:lla varmennettavia näytteitä oli 136 eli 7,2 % näytteiden kokonaismäärästä. Kun myös harmaan alueen 146 näytettä lasketaan mukaan, varmennettavien osuus oli 14,9 %, eli mikroskopoijan työmäärä kaksinkertaistui.

Kun mikroskopoitavan alueen positiivisia ja negatiivisia määritystuloksia tarkastellaan suhteessa näytteiden kokonaismäärään, kuva on täysin erilainen kuin verrattaessa niitä mikroskopoitavien näytteiden kokonaismäärään. Jälkimmäisessä tapauksessa se on lohduton: varmistettavista 282 näytteestä puolet on oikeita ja puolet vääriä positiivisia. Kemiallisissa analyyseissä tätä ei sallittaisi. Tulos korostaa laaduntarkkailun ja osaamisen tärkeyttä. Kun harmaan alueen positiivisia näytteitä verrataan näytteiden kokonaismäärään, niitä on todella vähän, vain 1,5 % (taulukko 1).

Tutkimuksessa käytetty akridiinioranssivärjäys on huomattavasti helpompi kuin gramvärjäys sekä tähän tarkoitukseen sopivampi. Koska näytteet voidaan mikroskopoida IF-tutkimuksen kanssa samanaikaisesti ja samoilla suodattimilla, tästä ylimääräisestä testistä ei juuri ole lisätyötä. Värjäämme akridiinioranssilla kaikki ne näytteet, jotka menevät IF-varmistukseen. Menetelmä antaa usein lisädiagnoosin tai ainakin selvittää, miksi EIA- ja IF-tutkimusten tulokset eroavat (taulukko 2, kuvat 1-4).

PÄÄTELMÄT

Chlamydia trachomatiksen diagnostiikassa yksi perinteinen testi ei riitä, vaan tarvitaan lisävarmistus toisella testillä. Tässä työssä käytetyn EIA-testin absorbanssin ilmoitettu alaraja 0,100 on liian matala; tämän selvityksen mukaan sen tulisi olla 0,030.

KIRJALLISUUTTA