Geenitekniikan menetelmät klamydiainfektion toteamisessa - onko viisasten kivi löytynyt?

Chlamydia trachomatis on teollistuneissa maissa yleisin sukupuoliteitse leviävä taudinaiheuttaja. Suomessa klamydiainfektioita ilmoitetaan yli 10 000 tapausta vuodessa, ja niiden esiintyvyys on viime vuosina pienentynyt vain vähän (1). Toisaalta klamydiainfektion tapaan tarttuva ja samoin keinoin ehkäistävissä oleva tippuri on vähentynyt 1970-luvulla todetuista 15 000 vuosittaisesta tapauksesta alle tuhanteen.

Miksi klamydiainfektion torjunnassa ei ole onnistuttu? Syitä voi olla useita. Klamydiainfektiot voivat olla vähäoireisia tai oireettomia, joten tartunnan saaneet voivat levittää tautia tietämättään. Lievien oireiden tai oireettomuuden vuoksi tartunnan ajankohta voi olla vaikeasti määritettävissä, joten jäljittäminen ja partnerien hoito jää usein puutteelliseksi. Lisäksi huonot tulokset voivat johtua epäherkistä laboratoriomenetelmistä.

Bakteerin eristäminen soluviljelyllä on säilynyt klamydiadiagnostiikan perusmenetelmänä, mutta menetelmän vaativuus ja työvaltaisuus on rajoittanut sen käytön harvalukuisiin viruslaboratorioihin. C. trachomatis -infektion yleistyttyä nykyisiin mittasuhteisiin on pyritty kehittämään viljelyä korvaavia menetelmiä. Näiden ensimmäistä sukupolvea edustavat immunokemialliset antigeeninosoitusmenetelmät, jotka ovat edelleen laajassa käytössä. Myös Suomessa valtaosa klamydianäytteistä tutkitaan antigeeninosoituksella. Laboratoriossa tutkittavien näytteiden määrästä riippuen tähän käytetään joko immunofluoresenssikoetta (IF) tai entsyymi-immunologista määritystä (EIA).

Antigeeninosoitusmenetelmissä tiedettiin jo niiden markkinoille tullessa olevan sekä herkkyyteen että spesifisyyteen liittyviä puutteita, ja näiden merkitys on korostunut menetelmien käytön levittyä asiantuntijalaboratorioiden ulkopuolelle. IF-testin ongelmat ovat etupäässä herkkyyteen liittyviä, kun taas suurten näytemäärien tutkimiseen paremmin soveltuvien EIA-menetelmien sekä herkkyydessä että spesifisyydessä on ollut puutteita. EIA-testien valmistajat suosittavatkin positiivisten tulosten varmistamista esimerkiksi IF-testillä, mutta klamydiadiagnostiikkaa on harjoitettu maassamme myös laboratorioissa, joilla ei ole teknisiä valmiuksia IF-testien käyttöön.

Epävarmoista klamydiadiagnooseista aiheutuvat ongelmatilanteet ovatkin tuttuja monille lääkäreille (2).

Antigeeninosoitustesteillä saavutetaan periaatteessa riittävä herkkyys (80-90 %) oireisten klamydiainfektioiden toteamisessa, mutta infektion itämisvaiheessa ja hoidon seurannassa erityisesti miespotilaiden näytteissä klamydiapartikkelien määrä saattaa olla niin pieni, että testien tulokset jäävät virheellisesti negatiivisiksi (3,4,5,6). Testien alle sataprosenttisesta spesifisyydestä aiheutuva virheellisten positiivisten tulosten riski taas korostuu ryhmissä, joissa klamydiainfektion esiintyvyys on vähäinen - esimerkiksi raskaana olevien naisten seulonnoissa.

Geenitekniikkaan perustuvien menetelmien on toivottu parantavan merkittävästi klamydian toteamista. Kokeet perustuvat joko klamydialle ominaisen geeniaineksen suoraan osoittamiseen näytteestä (koetintekniikka) tai spesifisen DNA-sekvenssin monistamiseen 10 000-100 000-kertaiseksi ennen osoitusreaktiota (geenimonistustekniikka). Geenitekniikoiden periaatteellisena etuna antigeeninosoitukseen verrattuna on niiden hyvä spesifisyys. Geenimonistus myös parantaa ratkaisevasti osoitusreaktion herkkyyttä.

Kaupallisina on tällä hetkellä saatavissa sekä koe-tintekniikkaan perustuva testi (PACE 2, Gen-Probe, San Diego, Calif., USA) että polymeraasiketjureak-tioon (PCR) perustuva geenimonistuskoe (Amplicor, F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Sveitsi).

TAYS:n kliinisen mikrobiologian yksikkö tutkii vuosittain 10 000-15 000 klamydian osoitusnäytettä. Vaikka klamydian esiintyvyys on näissä verrattain suuri (5-10 %), mukana on myös näytteitä varsinaisiin klamydiainfektion riskiryhmiin kuulumattomista potilaista. Tämä asettaa suuret vaatimukset paitsi testien herkkyydelle myös spesifisyydelle.

Tutkimuksessa arvioitiin runsaasti näytteitä tutkivaan laboratorioon soveltuvia klamydian osoitusmenetelmiä ja verrattiin uusien geeniteknologian menetelmien ominaisuuksia EIA-antigeeninosoitukseen.

AINEISTO JA MENETELMÄT

Tutkimukseen otettiin 234 naista, jotka hakeutuivat Tampereen kaupungin sukupuolitautien poliklinikkaan klamydiainfektioon viittaavien oireiden vuoksi tai joilla oli muu syy epäillä tuoretta klamydiatartuntaa. Edeltäneen kuukauden aikana antibioottihoitoa saaneet potilaat suljettiin pois tutkimusaineistosta. Kaikilta tutkimukseen osallistuneilta pyydettiin suullinen lupa tutkimusnäytteiden ottamiseen. Tutkimussuunnitelma oli hyväksytty sekä TAYS:n että Tampereen kaupungin sosiaali- ja terveystoimen eettisessä työryhmässä.

Näytteenotto

Näytteet otettiin kohdun kaulakanavasta. Ne otti sukupuolitautien poliklinikan vakituinen erikoissairaanhoitaja.

Ennen näytteenottoa kohdun kaulakanavan suu puhdistettiin limasta. Näytteitä otettiin kolme seuraavassa järjestyksessä kunkin testin valmistajan suosittamia välineitä käyttäen: RNA-hybridisaatiota varten, entsyymi-immunologista antigeeninosoitusta varten ja geenimonistusta varten. Näytteet antigeeninosoitusta ja RNA-hybridisaatiota varten säilytettiin jääkaappilämpötilassa ja tutkittiin viimeistään seitsemän päivän kuluttua näytteenotosta. Näytteet geenimonistusta varten säilytettiin -20 C:n lämpötilassa ja tutkittiin suurempina erinä viimeistään kolmen viikon kuluttua näytteenotosta.

Entsyymi-immunologinen antigeeninosoitus

Syvan MicroTrak-EIA:ssa (Syva Co., Palo Alto, Calif., USA) klamydia-antigeeni osoitetaan näytteestä C. trachomatis -spesifisen lipopolysakkaridivasta-aineen avulla. Määritys tehtiin valmistajan ohjeiden mukaan mikrotitterilevyillä. Entsyymireaktion tuottamat värireaktiot mitattiin fotometrillä aallonpituudella 450 nm. Positiivisen ja negatiivisen näytteen raja-arvo laskettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Näytteet, joiden absorbanssilukema oli EIA:ssa >= 0,100, varmistettiin IF-menetelmällä (Syva Co.). Ne käsiteltiin valmistajan ohjeiden mukaisesti ja tutkittiin fluoresenssimikroskoopilla käyttäen 500-1 000-kertaista suurennosta.

RNA-hybridisaatio

PACE 2 -RNA-hybridisaatiossa käytetään kemiluminesenssileimattua yksinauhaista DNA-koetinta, joka tunnistaa C. trachomatiksen ribosomaalisen RNA:n vastinnukleotidijärjestyksen. RNA-DNA-hybridisaation jälkeen sitoutumaton leimattu koetin erotetaan sitoutuneesta ja leimattu hybridi osoitetaan luminometrillä.

Määritys tehtiin valmistajan ohjeiden mukaan. Positiivisen testituloksen raja-arvona käytettiin valmistajan suosituksen mukaista negatiivisten vertailunäytteiden keskiarvolukemaan suhteutettua kemiluminesenssiarvoa.

Polymeraasiketjureaktio

Amplicor-PCR-menetelmässä monistetaan C. trachomatiksen plasmidi-DNA:sta spesifinen nukleotidijärjestys. Sen jälkeen leimatut monistetut nukleotidiketjut mitataan EIA-tekniikalla.

Määritykset suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaan, ja polymeraasiketjureaktiovaihe tehtiin Perkin Elmer Thermocycler TC 9600 -laitteella (Perkin Elmer, Cetus, Norwalk, Conn., USA). Mikrotitterilevyt mitattiin fotometrillä aallonpituudella 450 nm. Posi= 0,250. Näytteet, joista saatiin positiivinen tulos vain PCR-menetelmällä, varmistettiin Roche Diagnostic Systemsin PCR-laboratoriossa Baselissa toisella PCR-menetelmällä, joka perustuu membraaniproteiinia (MOMP) koodaavan DNA:n osoittamiseen.

TULOKSET

Näytettä pidettiin positiivisena, jos siitä saatiin positiivinen tulos vähintään kahdella menetelmällä tai jos se oli positiivinen PCR-kokeessa ja tulos varmistui MOMP-PCR-kokeessa. Näiden kriteerien mukaan positiivisia oli 42 (18 %) yhteensä 234 näytteestä. Näytettä pidettiin negatiivisena, jos tulos oli negatiivinen PCR- ja jommassa kummassa muussa kokeessa tai jos positiivinen PCR-tulos ei varmentunut MOMP-PCR-kokeessa. Näitä näytteitä oli 193 (82 %). Kaikilla kolmella menetelmällä yhtenevä tulos saatiin 219 näytteestä (94 %:ssa tapauksista) (taulukko 1).

= 0,2-0,3. Määrityksen herkkyys oli tällöin 81 %. Kun IF-varmistukseen otettavien näytteiden absorbanssiraja laskettiin= 0,1:een, herkkyys lisääntyi IF-testin ansiosta 88 %:iin. Kahdesta näytteestä saatiin EIA-antigeeninosoituksella positiivinen mutta IF-testissä negatiivinen tulos ja näytteet olivat negatiiviset myös geenimonistuksen ja RNA-hybridisaation perusteella. EIA-antigeeninosoituksen spesifisyys oli siten ilman IF-varmistusta 99 % ja IF-varmistuksella täydennettynä 100 %.

RNA-hybridisaatiomenetelmällä löydettiin 42 positiivisesta näytteestä 38 (herkkyys 91 %). Sillä löytyivät yhtä lukuun ottamatta kaikki EIA-kokeessa positiiviset näytteet. Lisäksi se antoi positiivisen tuloksen viidestä näytteestä, jotka jäivät EIA-antigeeninosoituksessa negatiivisiksi mutta olivat PCR-menetelmässä positiivisia.

PCR-määrityksellä löydettiin toistuvasti 42 positiivisesta näytteestä 37, jolloin herkkyys oli 88 %. Neljä näytettä oli toistuvasti positiivisia ainoastaan PCR-menetelmässä, ja niistä kolme varmistui positiivisiksi MOMP-PCR-kokeessa. Kolme neljästä EIA-antigeeninosoituksella ja RNA-hybridisaatiolla positiiviseksi todetusta näytteestä, joista PCR-menetelmä oli antanut negatiivisen tuloksen, muuttui positiivisiksi, kun potilasnäytteet tutkittiin uudelleen laimennettuina 1:10 ja 1:50. Jos näin olisi menetelty rutiinisti, PCR-menetelmällä olisi saavutettu 95 %:n herkkyys.

POHDINTA

Klamydiakokeiden luotettava vertailu on vaikeaa. Kahden menetelmän vertailu käy vielä helposti, jos näyte voidaan jakaa. EIA-antigeeninosoitusmenetelmien vertailuja on julkaistu runsaasti, ja tutkimuksessa käyttämämme testi edustaa tämän menetelmän parasta tasoa (5). Jos kerralla otettua näytettä ei voida jakaa, ylimääräisen näytteen ja siten vertailutuloksen saaminen on käytännössä hankalaa. Tämäkin tutkimus oli tehtävä naispotilaiden näytteistä, koska miehet olivat haluttomia suostumaan kivuliaaksi koettuun kahden ylimääräisen näytteen ottoon.

Voidaan myös epäillä, että otettaessa potilaasta useita näytteitä näytemateriaali vähenee tikku tikulta ja testi, jolla tutkitaan viimeiseksi otettu näyte, jää vertailussa epäedulliseen asemaan. Koska klamydia lisääntyy epiteelisolujen sisällä, huoli näytteen laimenemisesta ei kuitenkaan ole hyvin perusteltu. On jopa osoitettu, että useista peräkkäisistä klamydianäytteistä myöhemmät ovat useammin positiivisia kuin aikaisemmat (7). Koska vertailussamme kaikki menetelmät tuottivat vääriä negatiivisia tuloksia näytteenottojärjestyksestä riippumatta, todetut herkkyyserot vaikuttavat todellisilta.

Myös klamydiainfektion esiintyvyys tutkittavassa potilasaineistossa ja näytteenottotekniikka vaikuttavat vertailutuloksiin. Tämän tutkimuksen aineistossa klamydian esiintyvyys oli huomattavan suuri (18 %) ja näytteet otti kokenut erikoissairaanhoitaja. Sen vuoksi kaikilla vertailluilla testeillä saatiin varsin hyvät tulokset. On syytä olettaa, että herkkyys- ja spesifisyyserot olisivat korostuneet aineistossa, jossa klamydian esiintyvyys on pieni.

Suuren laboratorion käyttöön soveltuvista menetelmistä EIA-antigeeninosoitus on maassamme laajimmassa käytössä. Se on automatisoitavissa ja kustannuksiltaan edullinen, mutta edellyttää kaikkien positiivisten tulosten varmistamisen esimerkiksi IF-tutkimuksella. Tämän tutkimuksen tulos tukee sitä käytännön työssä syntynyttä käsitystämme, että IF-tarkasteluun olisi herkkyyden parantamiseksi ohjattava lisäksi suuri osa EIA-negatiivisista näytteistä. Se taas lisäisi menetelmän työvaltaisuutta ja todellisia kustannuksia huolimatta seulonnan automaatiosta. Valmistajan suosittaman käytännön mukaan toimittaessa EIA:n herkkyys oli vertailluista menetelmistä huonoin.

RNA-hybridisaation reagenssikustannukset ovat edulliset, mutta tulosten mittaamiseen tarvitaan erityinen luminometrilaitteisto. Hybridisaatiokoe osoittautui helppokäyttöiseksi, ja sen tulosten tulkinta on selväpiirteistä. Varmistamistarve koskee vain positiivisen ja negatiivisen raja-alueelle osuvia tuloksia ja on siten oleellisesti vähäisempi kuin EIA-antigeeninosoituksessa. Koe osoittautui EIA-testiä herkemmäksi, ja sen spesifisyys oli 100 %.

Geenimonistusmenetelmästä on toivottu huomattavaa edistystä klamydiadiagnostiikkaan, koska sen avulla on saavutettavissa sekä herkkyyden että spesifisyyden merkittävä parantuminen. Menetelmän käyttöönottoa on hidastanut sen vaikeus, monistukseen tarvittava erityislaitteisto ja suuret reagenssikustannukset. Monistusreaktioon liittyvän kontaminaatioriskin vuoksi laboratoriossa tarvitaan erityisiä tilajärjestelyjä sekä henkilökunnan perusteellinen koulutus. Kliinisen mikrobiologian tutkimuksiin erikoistuneessa laboratoriossa PCR-menetelmän käyttöönotto on onnistunut helposti, mutta se on selvästi työvaltaisempi kuin muut tässä vertailussa mukana olleet menetelmät.

Vaikka tutkimusaineistomme oli verrattain pieni, se riitti osoittamaan paitsi PCR-menetelmän spesifisyyden ja herkkyyden myös sen heikkoudeksi tiedetyn ns. polymeraasi-inhibitioon liittyvien väärien negatiivisten tulosten mahdollisuuden (8). Eräät positiiviset näytteet, joita tutkimusaineistossamme oli kolme (7 % kaikista positiivisista), saattavat sisältämiensä inhiboivien aineosien vuoksi aiheuttaa PCR-reaktion estymisen, ellei alkuperäistä näytettä laimenneta. Myös näytteen säilyttäminen pakastettuna ennen määritystä voi joskus poistaa inhibitio-ongelman. Inhibition aiheuttama virheprosentti osoittautui aineistossamme niin suureksi, että geenimonistuksen ja ilman geeniaineksen monistusta tehtävän RNA-hybridisaation välille ei syntynyt herkkyyseroa.

Klamydiatestien valintaan vaikuttavat kliinisissä mikrobiologian laboratorioissa monet seikat (9), mm. tutkittavien näytteiden määrä sekä laboratorion tekniset ja tiedolliset valmiudet. Suuria näytemääriä tutkittaessa testien tulisi olla mahdollisimman helppokäyttöisiä ja varmistustestien tarve pieni. Myös testien hinta aiheuttaa paineita kilpailutilanteessa toimiville laboratorioille.

Tutkimusten hintaerot eivät kuitenkaan saisi johtaa herkkyydeltään ja spesifisyydeltään puutteellisten testien käyttöön. Laadun kustannuksella saadut säästöt tarttuvan ja kroonisia komplikaatioita aiheuttavan taudin primaaridiagnostiikassa ovat näennäisiä ja aiheuttavat myöhemmin yhteiskunnalle kustannuksia, jotka ovat lyhyen tähtäimen säästöjä huomattavasti suurempia (10).

Klamydiadiagnostiikkaa suorittavien laboratorioiden tulee olla valmiita käyttämiensä menetelmien kriittiseen arviointiin ja niiden vaihtamiseen teknisen kehityksen myötä. Tässä tutkimuksessa molemmat geenitekniikan menetelmät osoittautuivat herkkyydeltään EIA-antigeeninosoitusta paremmiksi. Geenimonistusmenetelmät saattavat lähitulevaisuudessa muuttaa myös klamydianäytteiden ottoa, koska niiden herkkyys näyttää riittävän tartunnan toteamiseen myös virtsanäytteistä (11,12).

KIRJALLISUUTTA